BAB IV
PROGRAM KERJA MAGANG
A. Waktu dan Tempat
Praktik
Kerja Lapangan dilakukan pada tanggal 19 Juli sampai dengan 19 Agustus 2013.
Jam kerja yang diberikan sama dengan jam kerja karyawan, karena bertepatan
dengan bulan Ramadhan (puasa) maka ada sedikit perubahan jadwal kerja yaitu
untuk hari Senin sampai dengan Kamis masuk dari pukul 08.00 dan selesai pada
pukul 15.00 WIB. Pada hari Jumat masuk pukul 08.00 dan selesai pada pukul 15.30
WIB. Sedangkan pada hari Sabtu libur atau dapat dikatakan bahwa pada balai ini
menggunakan sistem 5 hari kerja. Praktik Kerja Lapangan dilaksanakan di Laboratorium
Bioteknologi Balai Besar Veteriner Wates, yang beralamat di Jalan Raya
Jogja-Wates Km. 27, Wates.
B. Alat dan Bahan
Ekstraksi
RNA virus AI dilakukan dengan kit ekstraksi RNA, sedangkan amplifikasi gen M
dan H5 secara RT-PCR dilakukan dengan kit SuperscriptIM III
RT/Platinum RT-PCR. Elektroforesis DNA hasil amplifikasi RT-PCR dilakukan
dengan menggunakan gel agarose, 10X TAE buffer, SYBR® Safe DNA
Gel, DNA Ladder, DNA Marker 100 Kb, dan dua pasang primer, yaitu primer M
dan primer H5.
Peralatan
yang digunakan pada deteksi virus AI adalah 7500 Real Time PCR System Applied
Biosystem, tabung steril 1,5 ml dan 0,2 ml, tip mikropipet ukuran 10, 100, 200,
dan 1000 μl), mikropipet, rak tabung, centrifuge, eppendorf, vortex
mixer, cetakan gel (tray), Geldoc.
C. Cara Kerja
·
Ekstraksi
RNA
1.
Carrier RNA ditambahkan ke dalam Lysis
buffer sesuai dengan jumlah yang telah dihitung, kemudian divortex.
2.
Proteinase K sebanyak 25 µl dimasukkan
ke dalam tabung 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 200 µl sampel.
3.
Kemudian ditambahkan ke dalam tabung
tersebut 200 µl campuran lysis buffer dan carrier RNA lalu divortex selama 15
detik.
4.
Diinkubasi pada suhu 56°C selama 15
menit. Kemudian sisentrifus sebentar untuk menurunkan sisa cairan yang terdapat
pada tutup tabung.
5.
Ditambahkan 250 µl etanol 96-100%,
divortex selama 15 detik dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang.
Kemudian disentrifus sebentar untuk menurunkan cairan dari tutup tabung.
6.
Semua cairan dipindahkan dari tabung
(~675 µl) ke dalam Viral Spin Column. Kemudian disentrifuge 8000 rpm selama 1
menit.
7.
Cairan/flow through dalam spin column dibuang, ditambahkan 500 µl wash
buffer ke dalam spoin column. Kemudian disentrifus 8000 rpm selama 1 menit.
8.
Cairan/flow through dalam spin column dibuang, ditambahkan kembali 500 µl
wash buffer ke dalam spoin column. Kemudian disentrifus 8000 rpm selama 1
menit.
9.
Spin column dipindah ke wash tube baru
(2ml) dan disentrifus dalam kecepatan maksimal selama 1 menit untuk mengeringkan
membran.
10. Spin
column dipindah ke tabung baru 1,5 ml (Recovery
tube). Lemudian ditambahkan 10-50 µl Rnase free water yang tersedia dalam
kit ke dalam spin column.
11. Diinkubasi
dalam suhu ruang selama 1menit. Kemudian disentrifus kecepatan maksimal selama
1 menit dan spin column dibuang.
12. RNA
disimpan dalam freezer -20°C atau langsung digunakan.
·
Master
Mix
RT-PCR
1.
Ke dalam tabung 1,5 ml ditambahkan
RNAase Free Water.
2.
Ditambahkan Primer F (25 µM).
3.
Ditambahkan Primer R (25 µM).
4.
Ditambahkan 2x Reaction Mix.
5.
Ditambahkan 2 µl SuperscriptIM
III RT/Platinum Taq Mix
6.
Dilakukan vortek dan sentrifuge selama 3
detik.
7. Dipindahkan
ke masing-masing sumuran pada tabung PCR sebanyak 19,5 µl sesuai dengan jumlah
sample.
8. Ditambahkan
ke masing-masing tabung PCR sebanyak 5,5 µl template RNA (RNA sample). Kontrol
Positif dan Kontrol Negatif.
Real
Time RT-PCR (RRT-PCR)
1.
Ke dalam tabung 1,5 ml ditambahkan
RNAase Free Water.
2.
Ditambahkan Primer F (18 µM).
3.
Ditambahkan Primer R (18 µM).
4.
Ditambahkan 2x Reaction Mix.
5.
Ditambahkan 2 µl SuperscriptIM
III RT/Platinum Taq Mix
6.
Flurogenic Probe (5 µM)
7.
Dilakukan vortek dan sentrifuge selama 3
detik.
8. Dipindahkan
ke masing-masing sumuran pada tabung PCR sebanyak 22 µl sesuai dengan jumlah
sample.
9. Ditambahkan
ke masing-masing tabung PCR sebanyak 5,5 µl template RNA (RNA sample). Kontrol
Positif dan Kontrol Negatif.
·
Running
PCR
RT-PCR
Konvensional
1.
Menyalakan Instrumen
2.
Membuat Protokol / Metode PCR
·
Reverse transcription (50˚C, 15 menit)
·
Predenaturasi (95˚C, 5 menit)
·
Denaturasi (95˚C, 15 detik)
·
Annealling (60˚C, 1 menit)
·
Ekstention (72˚C, 30 detik)
·
Post PCR (72˚C, 5 menit)
·
Siklus 40x
3.
Running
4.
Elektroforesis
Real
Time RT-PCR
1. Menyalakan
Instrumen
2.
Menyiapkan Rencana Run
3.
Membuat Plate Dokumen
4.
Memberi Nama Sample
·
Standard
·
NTC (None Template Control)
·
Unknown (Sample Target, Kontrol Positif,
Kontrol Negatif)
5.
Membuat Protokol / Metode PCR
·
Reverse transcription (50˚C, 15 menit)
·
Predenaturasi (95˚C, 5 menit)
·
Denaturasi (95˚C, 15 detik)
·
Annealling (60˚C, 1 menit)
·
Ekstention (72˚C, 30 detik)
·
Post PCR (72˚C, 5 menit)
·
Siklus 40x
6.
Running
7.
Analisis Data
·
Elektroforesis
1. Sebanyak
1,5 gram agarose dilarutkan dalam 100 ml buffer TBE 0,5x yang ditambah dengan 10
µl SYBR safe DNA kemudian dipanaskan mendidih selama 2 menit.
2. Agarose
dicetak dan dibiarkan sampai memadat kemudian dimasukkan ke dalam bak
elektroforesis yang telah diisi larutan buffer TBE 0,5x.
3. Sampel
sebanyak 5 µl dicampur dengan 2 µl loading
dye dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur dalam agarose.
4. Kemudian
dirunning dengan tegangan 100 volt selama 45-60 menit.
5. Hasil
diamati dengan UV menggunakan alat Geldoc.
