Enzim restriksi merupakan enzim yang membelah tulang belakang
gula-fosfat dari untai DNA. Mereka membawa fungsi pertahanan rumah untuk sel.
Enzim ini dapat mengenali urutan basa DNA spesifik dan membelah kedua untai
molekul DNA beruntai ganda pada atau dekat lokasi pengenalan. Semua enzim
restriksi dapat diklasifikasikan ke dalam tiga kelas: I, II dan III. Tipe II
adalah urutan-spesifik dan umumnya dikenal sebagai enzim restriksi. Berbeda
dengan endonuklease spesifik, enzim ini menghasilkan fragmen nukleotida yang
direproduksi dari DNA organisme tertentu. Mereka membelah doublestranded DNA
dengan hidrolisis dua ikatan fosfodiester (satu per untai) dalam urutan
nukleotida yang didefinisikan (Shikara et.al., 2009)
Saat ini dikenal empat jenis enzim nuklease restriksi.
Keempat jenis enzim ini digolongkan berdasarkan pada komposisi, jenis kofaktor,
target DNA yang akan dipotong, dan posisi sisi aktif enzim relatof terhadap
target DNA. Keempat jenis enzim tersebut antara lain :
- Tipe I , enzim membelah di
lokasi terpencil dari sisi pengenalan, membutuhkan baik ATP dan
S-adenosyl-L-methionine berfungsi; protein multifungsi dengan aktivitas
restriksi dan metilasi.
- Tipe II, enzim bersatu dalam
atau pada jarak tertentu dari sisi pengenalan, paling membutuhkan
magnesium, fungsi tunggal enzim tidak bergantung metilasi.
- Tipe III, enzim membelah di
lokasi jauh dari sisi pengenalan, membutuhkan ATP (tetapi tidak
menghidrolisisnya), S-adenosyl-L-metionin merangsang reaksi namun tidak
diperlukan, ada sebagai bagian dari kompleks modifikasi metilasi.
- Tipe IV, enzim menarget DNA
termetilasi
(Bickle,1993).
Tipe II DNA endonuklease restriksi umumnya berupa enzim
proteineous bakteri yang mengenali urutan nucelotide sasaran secara spesifik (situs
pengenalan/recognition site) dalam DNA beruntai ganda, yang menyebabkan
kerusakan obligasi internal antara nukleotida tertentu dalam target tersebut.
Mereka adalah bagian dari modifikasi restriksi bakteri sistem R-M, dan dapat
berfungsi melindungi sel terhadap DNA asing. Beberapa jenis bakteri sistem R-M
telah diklon, diurutkan dan diekspresikan terutama dalam sistem heterolog
karena memiliki aplikasi yang berpotensi dan bermanfaat secara komersial.
Restriksi endonuklease EcoRI adalah enzim restriksi tipe II yang secara khusus
mengakui dan memotong palindrom hexanucleotide yang terdefinisikan dengan baik
(GAATTC). Enzim restriksi ini terdiri dari polipeptida yang mengandung 277 asam
amino dan memiliki bobot molekul tunggal mencapai 29 kDa yang telah dimurnikan
sebelumnya dari strain bakteri Escherichia
coli klinis RY13 (Gholizadeh et.al., 2009)
Nomenklatur enzim restriksi berasal dari tiga huruf pertama
dari singkatan untuk setiap enzim restriksi mengacu pada spesies bakteri dari
mana enzim diisolasi (misalnya, Eco mengacu pada E. coli). Huruf keempat dapat
merujuk pada strain bakteri dari mana enzim diisolasi (huruf "R"
dalam EcoRI menunjukkan bahwa enzim ini diisolasi dari RY13 strain E. coli).
Angka Romawi yang mengikuti huruf memungkinkan enzim berbeda dari spesies yang
sama untuk diidentifikasi. Untuk kenyamanan, ahli genetika molekuler telah
menyebutksn dengan istimewa pengucapan nama-nama tersebut, misal : EcoRI
dilafalkan "echo-R-one," adalah HindIII "hin-D-three," dan
HaeIII adalah "hae-three." lafal ini umum tidak mematuhi
aturan-aturan formal dan hanya harus dipelajari (Pierce, 2002).
Perkembangan teknik-teknik biologi molekular, salah satunya
menciptakan teknik digesti yang dapat diaplikasikan dalam penelitian genetik
serta mempermudah dalam mendapatkan DNA yang mengkode gen spesifik dalam jumlah
besar. Selain itu, digesti merupakan salah satu teknik yang mendukung studi
ekspresi, struktur, dan organisasi gen. Metode tersebut juga mendukung
perkembangan industri bioteknologi yang telah menghasilkan banyak produk di
tingkat pasaran (Klug & Clummings, 1994).
Penamaan
Enzim Restriksi
- Huruf pertama adalah singkatan
nama genus bakteri pemilik enzim tersebut
- Huruf kedua dan ketiga adalah
singkatan nama spesies bakteri.
- Huruf keempat adalah dingkatan nama
Strain.
- Huruf kelima adalah urutan
penemuan enzim tersebut.
(Kurnia, 2011).
Misalnya EcoRI berasal dari Escherichia coli strain
RY13 yang pertama kali diidentifikasi, HindIII dari Haemophilus influenzae, dan
lain-lain (Kurnia, 2011).
Endonuklease restriksi mendegradasi DNA asing setelah
diperkenalkan ke dalam sel. Enzim ini mengenali urutan dasar tertentu, yang
disebut dengan urutan pengenalan atau situs pengenalan, dalam DNA target mereka
dan memotong DNA pada posisi yang telah ditentukan (Gana, et.al., 2012).
Beberapa Sifat Khusus
Enzim Restriksi
Isochizomer
Isochizomer adalah enzim-enzim restriksi yang memiliki situs
pengenalan yang sama. Hasil pemotongannya bisa sama dan bisa juga berbeda.
Misalnya HpaII (situs pengenalan: C↓CGG) dan MspI (situs pengenalan: C↓CGG)
adalah isoschizomer, begitu pula AatI (AGG↓CCT) dan StuI (AGG↓CCT).
Neoschizomer
Neoschizomer adalah bagian dari isoschizomer, memiliki situs
pengenalan yang sama tetapi memotong pada tempat yang berbeda sehingga hasil
pemotongannya pun berbeda. Misalnya AatII (situs pengenalan: GACGT↓C) dan ZraI
(situs pengenalan: GAC↓GTC)
(NEB, 2010).
Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek
akan menghasilkan banyak potongan DNA; sedangkan jika mempunyai sekuen
pengenalan yang panjang, akan dihasilkan potongan DNA yang lebih sedikit. Baik
enzim yang mempunyai sekuen pemotongan pendek maupun panjang, mempunyai fungsi
masing-masing dalam rekayasa genetika.
Beberapa enzim yang sering digunakan dalam laboratorium
dibagi menjadi tiga berdasarkan perkiraan pemotongan:
- 6-cutters
Ezim restriksi yang tergolong dalam 6-cutters memiliki situs
pemotongan yang spesifik pada 6 nukleotida. Ezim ini cocok digunakan untuk
pekerjaan kloning sehari-hari karena enzim ini sering memotong satu atau dua
situs pada plasmid, namun jarang memotong bagian penting seperti titik asal
replikasi (origin of replication) atau gen resisten ampisilin. Contoh enzim
6-cutters adalah HindIII (A↓AGCTT) yang memotong genom bakteriofage λ (48 kbp)
pada 7 situs.
- 8-cutters
Enzim restriksi ini mempunyai situs pengenalan sepanjang 8
nukleotida; cocok digunakan untuk membentuk kromosom menjadi potongan-potongan
yang spesifik dalam ukuran yang besar. Sebagai contoh: PacI (enzim 8-cutters)
memotong-motong kromosom E. coli menjadi 20 bagian, sedangkan BamHI (enzim
6-cutters) memotong sekitar 300 bagian. Jika langsung menggunakan enzim
6-cutters, maka fragmen yang dihasilkan terlalu kecil dan banyak. Untuk itu
digunakan enzim 8-cutters terlebih dahulu, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan
enzim 6-cutters.
- 4-cutters
Enzim restriksi ini cocok untuk percobaan yang menginginkan
pemotongan pada beberapa situs yang potensial. Contohnya: jika ingin
mengumpulkan fragmen DNA secara acak, dan pada potongan tersebut terdapat gen
yang diinginkan; dapat dilakukan digestsi parsial (partial digestion)
menggunakan enzim 4-cutters
(Old, 2003).
Sumber :
Bickle, T. A., D. H. Krüger. 1993. Biology of DNA restriction, Microbiological
Reviews 57. American Society for Microbiology.
Gholizadeh, Ashraf, B Baghdam Kohnehrouz. 2009.
Carborundum-dependent entrance of EcoRI restriction enzyme into plant cell and
specific of genomic DNA. Indian Journal
of Experimental Biology, Vol. 47, August 2009.
Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concept of genetics. 4th Ed. Prentice Hall, Englewood cliffs.
Kurnia, Ashfar. 2011. Dasar
Teknologi DNA Rekombinan. Universitas Indonesia : Jakarta
NEB, 2010. Isoschizomers.
New England Biolabs Inc.
Old, R.W., dan Primrose, S.B. (2003). Prinsip-prinsip Manipulasi Gen; Pengantar Rekayasa Genetika. UI
Press: Jakarta.
P.N., Gana, Abalaka M. E. 2012. The Principle and Application
of restriction enzyme in generic engineering. Asian Journal.
Pharmacy. Health. Science. Vol-2, 2012.
Pierce, B.A. 2002. GENETICS:
A Conceptual approach, 3th Ed. Paperback Inc.
Shikara, Mukaram, Nadia Tariq Barakat, Maysem Modaffer Al-Obaidy. 2009. A
Restriction Enzyme from Escherichia coli
Purification and General Properties. Eng.
& Tech. Journal, Vol.27, No.5, 2009
