Pembahasan
Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa mampu memahami dan
mampu untuk melakukan metode digesti dengan menggunakan enzim restriksi Eco RI
dan Hind III pada DNA bakteri gram negatif (-) E. coli dan DNA Kambing PE. Selain itu mahasiswa diharapkan dapat
melakukan perhitungan ukuran dari suatu fragmen DNA yang telah diproses secara
Elektroforesis.
Pada prinsipnya digesti ini berdasarkan pada pemotongan dsDNA
dari sampel yang telah tersedia pada suatu siklus yang spesifik dengan bantuan
enzim restriksi, yang dalam praktikum ini menggunakan Eco RI yang berasal dari Escherichia coli dan Hind III dari Haemophilus influenza Rd, yang telah
bersesuaian.
Enzim restriksi endonuklease mengenali urutan nukleotida
spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang
dikenalinya tersebut. Enzim ini telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu
sehubungan dengan fenomena pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan
modifikasi oleh virus bakteri. Bakteri pada mulanya tahan terhadap infeksi
virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan dengan merusak molekul DNA
asing yang masuk ke dalam selnya. Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan
pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia
coli, dan HindII dan HindIII dari Haemophilis
influenza Rd. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong DNA pada urutan basa
tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang
dapat disambungkan kembali. Para peneliti dengan cepat segera mengetahui bahwa
enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan untuk
mempelajari organisasi, fungsi, dan ekspresi gen. Enzim ini berperan dalam
sistem imun pada mikroorganisme (Sambrook, 1989).
Hingga saat ini, paling tidak sudah terdapat ribuan enzim
yang diperoleh dari berbagai jenis mikroorganisme. Beberapa di antaranya yang
terkenal dan sering digunakan adalah enzim EcoRV, HindIII, SacI, TaqI, BamHI, MspI
dan lain-lain (Stansfield, 2003).
Salah satu enzim restriksi yang digunakan pada percobaan ini
adalah EcoRI. Enzim EcoRI ini memotong DNA pada bagian yang urutan basanya
adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC). Di dalam sekuens
pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada senbarang situs tetapi
hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Pada DNA utas ganda,
sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan
arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian
antara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA
utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti
ini yang dikenal dengan istilah sticky
ends atau cohesive ends
(Tjahjoleksono, 2009).
EcoRI
Recognition Cut
5'GAATTC à 5'---G | AATTC---3'
3'CTTAAG à 3'---CTTAA | G---5'
Sedangkan untuk enzim HindIII memiliki situs pengenalan untuk dilakukan pemotongan
dengan urutan basa 5’-AAGCTT-3’ (utas atas) / 3’-TTCGAA-5’ (utas bawah).
HindIII
Recognition Cut
5'AAGCTT à 5'---A |
AGCTT---3'
3'TTCGAA à 3'---TTCGA |
A---5'
LANGKAH KERJA DAN
FUNGSI TIAP BAHAN
Pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA pada
suatu teknologi DNA rekombinan didasarkan pada beberapa hal, yaitu : ukuran
fragmen, blunt-ended atau sticky-ended fragment, sensitivitas terhadap
metilasi, dan kompatibiliti terhadap kondisi reaksi. Enzim restriksi dengan
sekuens pengenal lebih pendek akan menghasilkan lebih banyak potongan fragmen
DNA. Sticky ended pada umumnya lebih efisien dalam ligasi sedangkan blunt end
biasanya dikenali oleh enzim khusus yang cocok dengan tipe pemotongan blunt
ended. Faktor yang mempengaruhi keberhasilan aktivitas enzim restriksi adalah
berasal dari komposisi bufer dan suhu inkubasi pada langkah kerja yang telah
dilakukan (Gaffar, 2007)
Sumber :
Gaffar S. 2007. Buku
Ajar Bioteknologi Molekul. Universitas Padjajaran Press : Bandung
Sambrook, J., E.F. Fritsch, dan T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press : New York.
Stanfield W.D, J.S Colome, R.J Cano. 2006. Biologi Molekuler dan Sel. Jakarta:
Erlangga.
Tjahjolaksono, Aris. 2009. Teknologi DNA Rekombinan. IPB Press : Bogor
