Komponen
Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA
polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:
a.
Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida
pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau
polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh
DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu
menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan
dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki
sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel
mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.
b.
dNTP
(deoxynucleoside triphosphate)
dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA
yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu
dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.
c.
Buffer
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk
mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA
polymerase.
d.
Ion
Logam
Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor
bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat
bekerja. Sedangkan untuk Ion logam monovalen, yaitu kalsium (K+).
Alat dan Bahan dalam
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reagen khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan proses PCR
secara in vitro antara lain:
- Pasangan primer oligonukleotida
sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasi
- Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM
Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)
- Campuran dari empat dNTP (dGTP,
dATP, dTTP, dCTP) masing-masing sebesar 2,5 mM (ultra murni DNTP set,
Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran dibuat dengan volume 10 mM larutan
dari masing-masing empat dNTP terpisah yang digabung.
- Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM,
Perkin-Elmer/Cetus)
- Minyak mineral ringan
- Akrilamida (grade
elektroforesis)
- N, N’-Methylenebisacrylamide
(grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB)
- Amonium persulfat
(Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)
- TEMED (N, N, N’N
‘Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB)
Peralatan khusus yang yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR
antara lain:
- Mighty-small II SE-250 vertical
gel electrophoresis unit (Hoefer)
- Perkin-Elmer/Cetus Thermal
Cycler
- Sterile Thin-wall 0.5 ml
Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific).
Aplikasi teknik PCR
Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR
pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam
kebutuhan, diantaranya:
a.
Isolasi
Gen
Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat
besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya
mengandung ribuan gen. Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah
sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA
ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan
rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang
menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau
disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.
Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen
tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin
langsung dari pankreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes,
proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena
insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.
Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil
insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal
ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga. Hasilnya insulin yang
sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin
tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah
ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi. Untuk
mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang
memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini
bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen
tersebut.
b.
DNA
Sequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA
Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain
termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator,
dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda,
yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya
tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent
untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa
ditentukan.
c.
Forensik
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku
maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika
identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka
pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh
manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian
tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang
unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya
yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki
kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang
dimaksud. Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk
menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua
merasa ragu.
d.
Diagnosa
Penyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi
sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit
berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. PCR merupakan
teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam
hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi
daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang
tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.
Sumber :
