Definisi
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik
ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat
sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini
dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada
tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang
biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah
sampel yang kecil. Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses
sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode PCR
dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah
semula. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali
jumlahnya. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara
amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan
non-target.
Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi
DNA in vivo, yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda,
penempelan primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh
DNA polimerase dari arah terminal 5’ ke 3’. Hanya saja pada teknik PCR tidak
menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR dilakukan
dengan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida,
deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase
dalam larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campuran
secara berulang beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang
diinginkan.
PCR juga didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA
dengan menggunakan dua oligonukleotida primer yaitu komplementer dengan ujung
5’dari dua untaian skuen target. Oligonukleotida ini digunakan sebagai primer
(primer PCR) untuk memungkikan DNA template dikopi oleh DNA polimerase. Untuk
mendukung terjadinya annealing primer ini pada template pertama kali diperlukan
untuk memisahkan untaian DNA substrat melalui pemanasan.
Hampir semua aplikasi PCR menggunakan DNA polimerase yang tahan
terhadap panas, seperti polimerase Taq.
Awalnya enzim diisolasi dari bakteri Aquaticus Thermus. DNA polimerase
enzimatis ini merakit sebuah untai DNA baru dari pembangunan blok DNA,
nukleotida , dengan menggunakan DNA beruntai tunggal sebagai template dan
oligonukleotida DNA (juga disebut primer DNA ), yang dibutuhkan untuk inisiasi
sintesis DNA. Sebagian besar metode PCR menggunakan siklus termal , yaitu,
bergantian pemanasan dan pendinginan sampel PCR untuk serangkaian langkah pasti
suhu. Langkah-langkah siklus termal yang diperlukan pertama yang secara fisik
memisahkan dua helai dalam heliks ganda DNA pada suhu tinggi dalam proses yang
disebut DNA leleh . Pada suhu yang lebih rendah, masing-masing untai kemudian
digunakan sebagai template dalam sintesis DNA oleh polimerase DNA untuk
selektif memperkuat DNA target. Selektivitas hasil PCR dari penggunaan primer
yang komplementer ke wilayah yang ditargetkan untuk amplifikasi DNA di bawah
kondisi spesifik siklus termal.
Prinsip Kerja
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang
antara 20–30 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah
tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:
- Tahap peleburan (melting) atau
denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94–96 °C) ikatan
hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal.
Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5
menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini
menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat (“patokan”) bagi
primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.
- Tahap penempelan atau annealing.
Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya.
Ini dilakukan pada suhu antara 45–60 °C. Penempelan ini bersifat spesifik.
Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer
menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.
- Tahap pemanjangan atau elongasi.
Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase yang dipakai.
Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C.
Durasi tahap ini biasanya 1 menit.
Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat
denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi
templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi
oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan
terjadi secara ksponensial
Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan
satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya,
masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah
primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya,
kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer
mundur(reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer
mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5’ DNA
templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5’ ke 3’ atau
berarti dari ujung 3’ ke 5’ untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir
putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA templat awalnya
berupa sepasang untai DNA.
Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir
putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu
seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA
pendek sebanyak 2n – 2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen
yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen
pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk
digandakan (diamplifikasi).
