Variasi Teknik
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Ada banyak variasi dari PCR yang umum di kenal, antara lain:
a. Alel-spesifik
PCR : atau kloning teknik diagnostik yang didasarkan pada -nukleotida
polimorfisme tunggal (SNP) Hal ini membutuhkan pengetahuan sebelumnya dari
urutan DNA, termasuk perbedaan antara alel , dan menggunakan primer yang 3
'berakhir meliputi SNP. amplifikasi PCR dalam kondisi ketat jauh kurang efisien
dalam adanya ketidaksesuaian antara template dan primer, amplifikasi sukses
jadi dengan kehadiran sinyal primer spesifik-SNP dari SNP spesifik secara
berurutan.
b. Polymerase
Cycling Assembly (PCA): sintesis buatan urutan DNA yang panjang dengan
melakukan PCR di kolam oligonukleotida panjang dengan segmen tumpang tindih
pendek. The oligonukleotida bergantian antara rasa dan arah antisense, dan
segmen tumpang tindih menentukan urutan fragmen PCR, sehingga selektif
menghasilkan produk DNA panjang akhir.
c. Asymmetric
PCR : Menguatkan satu untai DNA dalam template DNA beruntai ganda. Hal ini
digunakan dalam sequencing dan hibridisasi probing amplifikasi hanya satu dari dua untai
komplementer diperlukan. PCR dilakukan seperti biasa, tetapi dengan kelebihan
besar primer untuk untai yang ditargetkan untuk amplifikasi. Karena (lambat
aritmatika amplifikasi) kemudian dalam reaksi setelah membatasi primer telah
digunakan Facebook, siklus PCR tambahan yang diperlukan.
d. Amplifikasi
tergantung helikase : mirip dengan PCR tradisional, tetapi menggunakan suhu
konstan daripada bersepeda melalui denaturasi dan annealing / siklus ekstensi.
DNA helikase , sebuah enzim yang unwinds DNA, digunakan di tempat denaturasi
termal.
e.
Hot
Start PCR : teknik yang mengurangi amplifikasi non-spesifik selama proses set
up awal tahapan PCR. Ini dapat dilakukan secara manual dengan memanaskan
komponen reaksi terhadap temperatur leleh (misalnya, 95°C) sebelum menambahkan
polimerase. Khusus sistem enzim telah dikembangkan yang menghambat polimerase,
aktivitas pada suhu sekitar, baik oleh mengikat dari antibodi atau oleh
kehadiran inhibitor yang terikat kovalen yang terdisosiasi hanya setelah suhu
aktivasi langkah-tinggi. Hot-start/cold-finish PCR dicapai dengan polimerase
hibrida baru yang tidak aktif pada suhu kamar dan akan segera diaktifkan pada
suhu perpanjangan.
f. PCR
spesifik Intersequence (ISSR): metode PCR untuk sidik jari DNA yang memperkuat
daerah antara mengulangi urutan sederhana untuk menghasilkan sidik jari yang
unik dengan panjang fragmen diperkuat.
g.
Inverse
PCR : umumnya digunakan untuk mengidentifikasi urutan mengapit sekitar genom
sisipan. Ini melibatkan serangkaian digestions DNA dan ligasi diri, sehingga
diketahui pada urutan kedua ujung urutan tidak diketahui.
h. Mediated
PCR Ligasi : menggunakan linker DNA kecil diligasikan dengan DNA kepentingan
dan beberapa primer anil ke linker DNA, tetapi telah digunakan untuk sekuensing
DNA , berjalan genom, dan DNA footprinting.
i.
PCR
spesifik Metilasi (MSP): dikembangkan oleh Stephen Baylin dan Jim Herman di
Johns Hopkins School of Medicine dan digunakan untuk mendeteksi metilasi dari
CpG pulau dalam DNA genom. DNA pertama diobati dengan natrium bisulfit, yang
mengubah unmethylated basa sitosin ke urasil, yang diakui oleh primer PCR
sebagai timin. Dua PCR kemudian dilakukan pada DNA dimodifikasi, menggunakan
primer set identik kecuali pada setiap pulau CpG dalam urutan primer. Pada
titik-titik ini, satu set primer mengakui DNA dengan sitosin untuk
mengamplifikasi DNA alkohol, dan satu set mengakui DNA dengan urasil atau timin
untuk mengamplifikasi DNA unmethylated. MSP menggunakan qPCR juga dapat
dilakukan untuk mendapatkan informasi kuantitatif daripada kualitatif tentang
metilasi.
j. Miniprimer
PCR : menggunakan polimerase termostabil (S-TBR) yang dapat memperpanjang dari
primer pendek ("smalligos") sesingkat 9 atau 10 nukleotida. Metode
ini memungkinkan menargetkan untuk mengikat PCR primer daerah yang lebih kecil,
dan digunakan untuk memperkuat sekuens DNA, seperti atau eukariotik 18S rRNA).
k. Multiplex
Ligasi-dependent Probe Amplifikasi (MLPA): izin beberapa sasaran diperkuat
dengan hanya sepasang primer tunggal, sehingga menghindari keterbatasan
resolusi PCR multipleks.
l. Multiplex-PCR
: terdiri dari beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk
menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang
berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh
dari lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan
lebih banyak waktu untuk melakukan. temperatur Annealing untuk masing-masing
set primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal,
dan ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup
untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis
gel.
m. Nested PCR : meningkatkan kekhususan
amplifikasi DNA, dengan mengurangi latar belakang karena khusus non amplifikasi
DNA. Dua set primer yang digunakan dalam dua PCR berturut-turut. Dalam reaksi
pertama, sepasang primer digunakan untuk menghasilkan produk DNA, yang selain
target yang dimaksud, masih dapat terdiri dari fragmen DNA non-khusus
diperkuat. Produk (s) yang kemudian digunakan dalam PCR kedua dengan satu set
primer yang mengikat situs sebagian atau seluruhnya berbeda dari dan terletak 3
'dari masing-masing primer yang digunakan dalam reaksi pertama. Nested PCR
sering lebih berhasil dalam memperkuat fragmen spesifik DNA yang panjang dari
PCR konvensional, tapi membutuhkan pengetahuan lebih rinci tentang urutan
target.
n. Tumpang
tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan tumpang tindih ekstensi (BUMN): sebuah
rekayasa genetika teknik yang digunakan untuk splice bersama lebih fragmen DNA
atau dua yang berisi urutan komplementer. Hal ini digunakan untuk bergabung
dengan potongan DNA yang mengandung gen, urutan peraturan, atau mutasi, teknik
tersebut memungkinkan penciptaan DNA spesifik dan panjang konstruksi.
o.
Kuantitatif
PCR (Q-PCR): digunakan untuk mengukur jumlah produk PCR (umum secara
real-time). Ini secara kuantitatif jumlah ukuran mulai DNA, cDNA, atau RNA.
Q-PCR biasanya digunakan untuk menentukan apakah urutan DNA hadir dalam sampel
dan jumlah salinan dalam sampel. Kuantitatif real-time PCR memiliki tinggi
tingkat yang sangat presisi. QRT-PCR metode menggunakan pewarna fluorescent,
seperti Sybr Green, EvaGreen atau fluorophore DNA probe yang mengandung seperti
TaqMan, untuk mengukur jumlah produk yang diperkuat secara real time. Hal ini
juga kadang-kadang disingkat RT-PCR (R T ime Bit PCR) atau RQ-PCR. QRT-PCR atau
RTQ-PCR sesuai kontraksi lebih, karena RT-PCR umumnya mengacu pada reverse
transkripsi PCR (lihat di bawah), sering digunakan dalam hubungannya dengan
Q-PCR.
p. RT
reverse transcription PCR (RT-PCR): untuk memperkuat DNA dari RNA. Reverse
transcriptase mentranskripsi RNA menjadi cDNA , yang kemudian diamplifikasi
dengan PCR. RT-PCR secara luas digunakan dalam profiling ekspresi , untuk
menentukan ekspresi gen atau untuk mengidentifikasi urutan dari transkrip RNA,
termasuk start transkripsi dan situs penghentian. Jika urutan DNA genom gen diketahui,
RT-PCR dapat digunakan untuk memetakan lokasi ekson dan intron dalam gen. 5
'akhir dari gen (sesuai dengan awal transkripsi) biasanya diidentifikasi oleh
RACE-PCR (Rapid Amplifikasi cDNA End).
q. PCR
Thermal asimetris interlaced ( TAIL-PCR ): untuk isolasi dari suatu urutan yang
tidak diketahui mengapit urutan yang dikenal. Dalam urutan diketahui, TAIL-PCR
menggunakan sepasang nested primer dengan suhu yang berbeda anil; degenerate
primer digunakan untuk memperkuat yang lain dari arah yang tidak diketahui.
r.
Touchdown
PCR (Langkah-mundur PCR): sebuah varian dari PCR yang bertujuan untuk
mengurangi latar belakang spesifik secara bertahap menurunkan suhu anil sebagai
bersepeda PCR berlangsung. Suhu anil pada awal siklus biasanya beberapa derajat
(3-5 ° C) di atas m T primer yang digunakan, sedangkan pada siklus kemudian,
ini adalah beberapa derajat (3-5°C) di bawah T primer m. Suhu tinggi memberikan
spesifisitas yang lebih besar untuk primer mengikat, dan suhu yang lebih rendah
izin lebih amplifikasi efisien dari produk tertentu terbentuk selama siklus
awal.
