Adapun tahapan pembuatan preparat metode parafin adalah
sebagai berikut :
Sampling
Merupakan proses awal dalam metode parafin. Pada sampling
ini diambil beberapa organ sesuai keperluan. Jika organ terlalu besar maka
dipotong-potong terlebih dahulu.
Pengambilan jaringan :
- Harus secepatnya di ambil terutama pada kadafer
- Pemotongan harus dengan pisau yang tajam
- Ukuran potongan sebaiknya 1 cm
- Secepatnya difiksasi
Tujuannya untuk mencegah terjadinya perubahan-perubahan
pasca mati dan perubahan struktur lain yang dapat menyesatkan dalam pengamatan.
Kesulitan dari tahap ini adalah waktunya yang sedikit harus dipercepat dalam
pengerjaannya sehingga terkesan menjadi terburu-buru.
Fiksasi (fixation)
Tujuan utama fiksasi adalah memberikan perlakuan tertentu
terhadap elemen-lemen jaringan, terutama inti sel atau nukleinya, sehingga
dapat diwetkan dalam kondisis yang sedikit banyak mendekati keadaan aslinya.
Selain itu, fiksasi juga mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang
disebabakan oleh mikroorganisme maupun perusakan oleh enzim yang terkandung
dalam jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis.
Dengan kata lain
fiksasi bertujuan :
- Mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme) jaringan dengan cepat sehingga keadaannya sedikit banyak mendekati keadaan aslinya.
- Mencegah autolisis
- Menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras yang merupakan komponen cairan fiksatif.
Kesulitan dari tahap ini hanyalah memerlukan waktu yang
lama untuk pengerjaannya, karena fiksasi membutuhkan waktu yang lama untuk
dapat membuat spesimen awet.
Dehidrasi (dehydration)
Dehidrasi adalah proses mengeluarkan air dari dalam
jaringan tisu dengan menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi merupakan
langkah penting yang memerlukan perlakuan yang prosesnya tidak terputus-putus.
Kesalahan yang terjadi akan mengakibatkan terhalangnya proses penamanan dalam
parafin yang merupakan proses lanjutan setelah proses dehidrasi tersebut.
Sehubungan dengan hal itu maka dehidran yang kita gunakan hedaklah memenuhi
beberapa persyaratan sebagai berikut :
- Harus mampu menarik air dari tisu menggantikan kedudukan air tersebut
- Dehidran itu sendiri dapat digantikan kedudukannya oleh medium penjernih
- Tidak merusak dan mengganggu tisu yang telah difiksasi sebelumnya sehingga misalnya tisu akan menjadi terlalu lunak kembali ataupun malah memperkeras tisu tersebut menjadi rapuh.
Kesulitan dari tahap ini adalah dalam pemilihan dehidran
yang digunakan agar sesuai sehingga tisu tidak menjadi terlalu lunak dan malah
menjadi terlalu keras.
Penjernihan (clearing)
Tujuan utama proses penjernihan adalah menggantikan tempat
alkohol dalam tisu yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven
atau medium penjernih menjelang proses penanaman sebelum dilakukan proses
penyayatan. Setelah kita menggunakan xylol atau benzene pada proses penjernihan
ini, pada umumnya tisu akan menjadi transparan : hal ini yang menjadi alasan
bahwa hal ini dikenal sebagai proses penjernihan. Lama tisu dalam medium
penjernih bergantung pada :
- Ketebalan serta tingkat kepadatan tisu
- Jenis reagen yang dipakai
- Untuk jenis tisu yang melalui proses dehidrasi dengan sempurna, maka proses penjernihan (xylol, benzene) berlangsung selama setengah hingga tiga jam. Bila tisu dibiarkan cukup lama dalam medium penjernih ini, maka besar kemungkinan tisu akan menjadi keras dan rapuh yang tentu menyukarkan dalam penyayatan.
Kesulitan dari tahap ini adalah adalah ketepatan waktu yang
dibutuhkan saat penjernihan ini sendiri. Karena jika terlalu lama dapat membuat
tisu menjadi keras dan rapuh untuk tahap penyayatan.
Infiltrasi (infiltration)
Yang dimaksud dengan infiltrasi yaitu usaha menyusupkan
media penanaman kedalam tisu dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan
bahan penjernih. Media penamanam/embedding yang umum dipakai adalah parafin. Untuk
jenis tisu hewan yang biasanya digunakan parafin bertitik didih 58°C. Sebelum
jaringan masuk kedalam parafin murni maka tisu terlebih dahulu berada dalam
xylol.
Kesulitan dalam tahap ini adalah teknik yang harus
dilakukan untuk menyusupkan media penanaman ke dalam tisu.
Penanaman (embedding)
Penanama merupakan proses memasukkan atau menanam tisu
kedalam blok-blok parafin (cetakan) sehingga memudahkan pada proses penyayatan
dengan bantuan mikrotom. Beberapa teknik percetakan tersebut menggunakan :
- Cetakan terbuat dari timah atau logam berat lainnya yang berbentuk L dialas kaca dengan cara ini satu persatu tisu akan dapat dicetak.
- Cetakan terbuat dari kertas. Sebaiknya disiapkan dari bahan kertas karton atau manila
- Cetakan berbentuk bak yang terbuat dari aluminium, dengan cara ini tisu dapat ditanamkan sekaligus.
Kesulitan tahap ini adalah pemilihan teknik dan pemilihan
cetakan yang tepat untuk dapat dimasukkan dalam tisu agar sesuai dengan
kebutuhan spesimen.
Pemotongan (section)
Proses penyayatan mencakup berbagai cara akan menghasilkan
sayatan tipis tisu baik yang telah mengalami proses penanaman maupun tidak.
Dalam mikroteknik, cara lazim digunakan adalah penyayatan dengan menggunakan
mikrotom dengan berbagai peralatan pembantu seperti pisau mikrotom, kuas bulu,
spatula, gunting serta pensil penoreh. Mikrotom adalah Alat khusus yang
diracang untuk menyayat material atau tisu-tisu dengan sayatan-sayatan yang
cukup tipis untuk penelaahan dengan mikroskop.
Kesulitan dalam tahap penyayatan ini adalah cara
penyayatan, keterampilan dalam menyayat, karena pada tahap penyayatan ini akan
dihasilkan spesimen yang sangat tipis agar dapat dilihat pada mikroskop.
Afiksasi (afixing)
Afiksasi atau proses perlekatan adalah proses perlekatan
atau penetapan sayatan tisu yang pada kaca preparat dengan bantuan media prekat
tertentu. Kesulitan dari tahapan ini adalah ketepatan dalam melakukannya pada
kaca preparat. Jika terjadi kesalahan posisi akan sulit digunakan.
Deparafinisasi
Deparafinisasi adalah proses penghilangan parafin
menggunakan xylol. Adapun langkah-langkah deparafinisasi adalah :
- Jaringan dimasukkan kedalam xylol (xylol 1 dan xylol 2) masing-masing selama 30 menit
- Redehidrasi dengan alkohol dari tinggi ke rendah (100%, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) kemudian cuci dengan air mengalir setelah itu celupkan ke dalam akuades.
Pewarnaan (staining)
Pewarnaan bertujuan agar dapat mempertajam atau memperjelas
berbagai elemen tisu, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan
ditelaah dengan mikroskop. Motoda pewarnaan yang sering dilakukan dalam
pembuata preparat metode parafin adalah metoda pewarnaan Hematoxilin-eosin.
Seperti merupakan peraturan, hamatoxillin digunakan
terlebih dahulu dan setelah melalui proses diferensiasi, maka barulah eosin
digunakan. Pertukaran tempat keduanya tampaknya akan menimbulkan kesukaran,
karena pewarna hematoxilin akan mewarnai lebih cepat dari pada pewarna
paduannya yang umumnya berperan sebagai counterstain yang intensitas
pewarnaanya dapat diatur tanpa mempengaruhi pewarnaan hematoxilin.
Kesulitan tahapan ini adalah memilih jenis pewarna, karena
dengan ketepatan pemilihan bahan pewarna dapat menyesuaikan bagian apa pada
spesimen tersebut yang akan dilihat. Jika terjadi kesalahan dapat terjadi
kekeliruan dalam tujuan penglihatan spesimen.
Mounting
Merupakan proses akhir dari pembuatan preparat metoda
parafin. Sebelum ditutup secara permanen maka sebaiknya jaringan dilihat pada
mikroskop apakah jaringan tersebut sudah dapat diamati dengan baik atau tidak.
Pada mounting tutup dengan canada balsem dan gelas penutup. Hindari terbentuk
gelembung udara kemudian beri label dan diamati kembali diwabah mikroskop.
Kesulitan pada tahapan ini adalah keterampilan pada
penutupan spesimen agar tidak terdapat gelembung-gelembung yang tersisa
sehingga nantinya saat diamati pengamatan spesimen tersebut tidak terganggu.
Sumber :
