Digesti merupakan proses pemotongan fragmen DNA dengan
menggunakan suatu enzim khusus yaitu enzim restriksi. Enzim restriksi yang
digunakan yaitu enzim restriksi endonuklease yang akan mengenali dan memotong
fragmen DNA pada sekuen yang spesifik. Fragmen yang dipotong akan digabungkan
dengan suatu fragmen DNA lain yang berperan sebagai vektor. Vektor merupakan
molekul DNA yang dapat bereplikasi secara autonom yang akan memfasilitasi
proses manipulasi dan identifikasi molekul DNA rekombinan yang terbentuk (Klug
& Cummings, 1994).
Dan menurut Lodish (2004) digesti juga dinamakan dengan
restriksi DNA. Restriksi DNA adalah proses pemotongan DNA baik untai ganda
maupun untai tunggal dengan menggunakan enzim DNA restriksi (DNA nuklease) pada
sisi spesifik yang dikenal sebagai sisi pengenalan (recognition site). Pada
organisme, enzim ini digunakan untuk mendegradasi fragmen DNA asing yang
masukke dalam sel, misalnya DNA virus. DNA organisme itu sendiri aman dari
proses restriksi karena mengalami proses metilasi.
Prinsip dasar dari teknologi DNA rekombinan adalah sebuah
golongan enzim yang disebut restriksi endonuklease. Enzim ini diisolasi dari
bakteri, diperoleh dari namanya karena mereka membatasi atau mencegah infeksi
virus dengan memotong asam nukleat yang datang. Enzim restriksi mengenal sebuah
sekuen nukleotida spesifik dan menghasilkan suatu kerusakan dobel helix di
dalam atau di dekat dari sekuens (Klug & Cummings, 1994).
Situs pemotongan enzim restriksi terdapat dua macam, yaitu di
dalam lokus dan di tepi lokus, atau bisanya disebut eksonuklease dan
endonuklease. Sedangkan hasil pemotongan terdapat dua yaitu, blunt end dan
sticky end. Blunt end menghasilkan hasil akhir pemotongan yang tumpul,
sedangkan pada sticky end menghasilkan pemotongan yang lancip. Pemotongan blunt
end menghasilkan masalah ketika dicoba untuk diklonkan. Hal ini berbeda dengan
hasil sticky end yang lebih efisien (Reece, 2004). Pemotongan enzim restriksi
yang dapat menghasilkan ujung yang dinamakan “sticky” yang dapat saling
menempel antara ujung DNA satu dengan ujung DNA yang lain. Kedua DNA dengan
ujung sticky jika ditempatkan pada kondisi yang tepat, maka dapat membentuk
molekul rekombinan dengan menempelkan kedua ujungnya. Penempelan kedua ujung
dibantu oleh enzim ligase (Klug & Cummings, 1994).
Dua jenis enzim erestriksi endonuklease telah ditemukan, dan
lebih dari 80 enzim dari ketiga tipe sudah dikenali. Enzim restriksi tipe I
mengenali suatu DNA pada suatu lokasi secara acak pada beberapa jarak dari
situs pengenalannya. Enzim restriksi tipe II mengenali suatu sekuens spesifik
dan memotong dengan tepat kedua untai di dalam sekuens. Enzim restriksi tipe II
ini, situs pengenalannya berupa palindromik yang membaca secara sama arah 5’ ke
3’ pada untai komplementer. Tipe III enzim restriksi mengenali urutan DNA yang
spesifik dan memotong di dekat situs pengenalannya, biasanya sekitar 25 bp.
Dari 3 jenis, enzim tipe II yang sering digunakan pada genetic engineering.
Satu diantara enzim yang ditemukan berasal dari E. coli dan telah diberi nama
ECoR1 (Klug & Cummings, 1994; Pierce, 2002).
Nomenklatur enzim restriksi berasal dari tiga huruf pertama
dari singkatan untuk setiap enzim restriksi mengacu pada spesies bakteri dari
mana enzim diisolasi (misalnya, Eco mengacu pada E. coli). Huruf keempat dapat
merujuk pada strain bakteri dari mana enzim diisolasi (huruf "R"
dalam EcoRI menunjukkan bahwa enzim ini diisolasi dari RY13 strain E. coli).
Angka Romawi yang mengikuti huruf memungkinkan enzim berbeda dari spesies yang
sama untuk diidentifikasi. Untuk kenyamanan, ahli genetika molekuler telah
menyebutksn dengan istimewa pengucapan nama-nama tersebut, misal : EcoRI
dilafalkan "echo-R-one," adalah HindIII "hin-D-three," dan
HaeIII adalah "hae-three." lafal ini umum tidak mematuhi
aturan-aturan formal dan hanya harus dipelajari (Pierce, 2002).
Enzim endonuklease restriksi yang sangat selektif dalam
memotong untai DNA sangat bermanfaat bila diaplikasikan pada teknologi DNA
rekombinan. Setiap enzim mengalami rangkaian 4-8 pasang basa tertentu yang
terdapat dalam untai DNA. Bagian atas situs pada molekul DNA yang dikenali oleh
enzim endonuklease restriksi dikenal sebagai situs pemotongan enzim.
Rangkaian-rangkaian situs pemotongan DNA oleh enzim ini apabila terdapat dalam
genom bakteri itu sendiri, biasanya dilindungi dengan adanya gugus metil pada
residu basa adenine (A) dan sitosin (C), sehingga tidak dapat dipotong oleh
enzim endonuklease yang dihasilkan oleh bakteri sendiri. Setiap enzim
endonuklease restriksi memiliki situs pengenalan pemotongan yang berbeda dan
sangat spesifik (Radji, 2011).
Enzim endonuklease restriksi yang berbeda, memiliki situs
pemotongan yang berbeda, namun ada beberapa jenis enzim endonuklease restriksi
yang diisolasi dari sumber yang berbeda memiliki situs pemotongan yang sama. Enzim-enzim
endonuklease restriksi yang memiliki situs pemotongan yang sama disebut
isochizomer (Radji, 2011).
Sekuens basa DNA pada situs pemotongan memiliki urutan basa
yang sama pada untai DNA heliks ganda, yang dikenal dengan sekuens palindromik.
Misalnya enzim EcoRI, yang diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun
1969 dari Escherichia coli yang memotong DNA pada bagian antara basa G dan A
pada sekuens GAATTC (Radji, 2011).
Enzim yang memotong molekul DNA heliks ganda tidak berhadapan
langsung, tetapi selisih 2-4 basa menghasilkan potongan dengan ujung lengket,
sedangkan enzim yang memotong pada tempat yang berhadapan menghasilkan ujung
tumpul (Radji, 2011).
Enzim restriksi EcoRI, memotong molekul DNA pada urutan
heksa-nukleotida 5’—GAATTC—3’ pada posisi antara basa G dan A. demikian pula
pada urutan polindromiknya 3’—CTTAAG—5’ enzim EcoRI, juga memotong pada posisi
antara basa A dan G. dengan demikian molekul DNA heliks ganda yang terpotong
oleh enzim EcoRI, menghasilkan fragmen restriksi dengan kedua ujung yang
lengket (Kurnia, 2011).
Perkembangan teknik-teknik biologi molekular, salah satunya
menciptakan teknik digesti yang dapat diaplikasikan dalam penelitian genetik
serta mempermudah dalam mendapatkan DNA yang mengkode gen spesifik dalam jumlah
besar. Selain itu, digesti merupakan salah satu teknik yang mendukung studi
ekspresi, struktur, dan organisasi gen. Metode tersebut juga mendukung
perkembangan industri bioteknologi yang telah menghasilkan banyak produk di
tingkat pasaran (Klug & Clummings, 1994).
Sumber :
Klug, W. S.
& M. R. Cummings. 1994. Concept of
genetics. 4th Ed. Prentice Hall, Englewood cliffs.
Kurnia,
Ashfar. 2011. Dasar Teknologi DNA
Rekombinan. Universitas Indonesia : Jakarta
Radji, M. (2011). Rekayasa
Genetika; Pengantar untuk Profesi Kesehatan. Sagung Seto: Jakarta.
