ACARA I ISOLASI DNA GENOM dari Escherichia coli
- Genom merupakan gugus atau himpunan gen yang lengkap dari suatu organisme yang mengendalikan kesuluruhan metabolisme sehingga organisme tersebut dapat hidup dengan sempurna. Genom dapat digunakan untuk menunjukkan keseluruhan kode gemetik pada kromosom yang ada pada suatu organisme.
- Prinsip Pokok Isolasi DNA
· Presipitasi
: Suatu cara untuk mengendapkan DNA dan memisahkan DNA dari pengotornya.
· Sentrifugasi
: Memisahkan dua subtansi dengan berat molekul yang berbeda antara yang lebih
berat dan yang lebih ringan.
- Fungsi-Fungsi Larutan
- Digestion Solution (180µl) :
Untuk melisiskan membran.
- Lisis Solution (200µl)
(konsentrasi garam tinggi) : membantu memaksimalkan digestion solution.
- Protein Ase K (20µl) :
membersihkan kandungan protein yang ada.
- Elution Buffer (200µl)
(Konsentrasi garam rendah) : mengikat pengotor selain DNA agar DNA
terpisah sempurna dari pengotor.
- Plasmid : DNA sirkuler yang ada
di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom.
- RNAase : Untuk mengikat RNA
yang termasuk dalam pengotor.
- Ethanol 50 % (400µl) : Untuk
melarutkan senyawa lain selain DNA.
- Wash Buffer (500µl) : Untuk
mencuci DNA dari pengotor.
ACARA II ELEKTROFORESIS
- Prinsip Kerja : Migrasi fragmen
DNA yang bermuatan negatif ke kutub positif tangki elektroforesis melalui
membran matrix gel agarose akibat dialiri medan listrik.
- Elektroforesis adalah teknik
pemisahan senyawa yang memiliki muatan dengan meletakkannya pada medan
listrik.
- Gel yang digunakan Gel Agarose
karena gel agarose memiliki kemampuan untuk menampung ukuran fragmen yang
lebih besar.
- Gel agarose yang digunakan
memiliki konsentrasi 0,8 %, karena dengan konsentrasi tersebut diharapkan
ideal bagi ukuran fragmen yang dipakai pada praktikum ini.
- Pada prinsipnya dalam memilih
konsentrasi gel agarose semakin besar konsentrasi gel agarose yang
digunakan semakin kecil ukuran fragmen yang dapat digunakan.
- Running Elektroforesis ini
bertipe Reptetion (Seperti Reptil).
- Buffer TAE (50ml) : Memiliki
fungsi sebagai penyangga dan media penghantar listrik yang tepat.
- Loading Dye (1µl) : Berisi
pelarut ddH2O, Pewarna Bromophenol Blue/Silen Silanol, pemberat
Sukrosa/Gliserol.
- Ethidium Bromida (EtBr) :
Berfungsi untuk mengikat DNA dan menyebabkan DNA yang ada pada gel agarose
dapat berpendar saat disinari UV.
- Elektroforesis ada dua macam :
Elektroforesis Horizontal dan Vertikal.
- Berdasarkan jenisnya
Elektroforesis terbagi menjadi dua, yaitu : Elektroforesis Zona dan
Elektroforesis Bebas.
- Elektroforesis Bebas : Molekul
yang akan dipisahkan disebar ke seluruh permukaan gel, dan kemudian diliri
listrik. Akibat aliran listrik tersebut akan membentuk batas diantara dua
larutan.
- Elektroforesis Zona : Molekul
diletakkan pada zona – zona yang telah dibuat dan ditentukan, yang
kemudian dialiri listrik. Akibat dari aliran listrik tersebut terjadinya
migrasi.
- Power Supply yang digunakan :
400mA, 90 V, 30 Menit.
- Marker yang digunakan 3µl, 1 kb.
- Faktor yang mempengaruhi
Elektroforesis :
- Ukuran Molekul DNA
- Konsentrasi Gel
- Bentuk Molekul
- Arus Listrik dan Voltase
- Arah Medan Listrik
- Densitas Muatan
- Gel Doc : Perangkat digital yang
digunakan untuk mendokumentasikan hasil elektroforesis yang memanfaatkan
sinar UV untuk memendarkan fragmen DNA.
- Componen Gel Doc : Camera,
Komputer (Software), dan Sinar UV.
ACARA III Polymerase Chain Reacion (PCR)
- PCR : Teknik memperbanyak atau
mengamplifikasi suatu sekuens tertentu dari total DNA.
- Prinsip Dasar : Reaksi
polimerase berulang yang dimulai dari suatu primer yang dirancang khusus
untuk memperbanyak sekuens target.
- Primer : Oligonukleotida pendek
sekitar 20 bp yang pada urutan basanya sama pada ujung-ujungnya.
- Primer ada 2 : Primer Forward
dan Primer Reverse.
- Primer Forward : Menginisiasi
sintesis untai DNA dari ujung 5’ ------- 3’.
- Primer Reverse : Menginisiasi sintesis
untai DNA dari ujung 3’ ------- 5’.
- Tahap Tahap PCR :
- Pre-Denaturasi : Tahap ini merupakan tahap untuk mempersiapkan proses berikutnya, yaitu denaturasi (Pemanasan), Suhu yang digunakan 95°C. Hanya terdiri dari satu siklus selama 5 menit.
- Denaturasi : Tahap pemisahan antara untai satu dengan yang lain sehingga masing – masing menjadi untai tunggal. Suhu yang dipakai 94°C. Proses yang tidak sempurna dapat memutuskan rantai DNA. Jika terlalu lama dapat menghilangkan aktivitas enzim polimerase.
- Annealing : Tahap terpenting. Faktor yang mempengaruhi adalah
suhu annealing dan primer. Suhu rendah dapat mengakibatkan primer tidak
dapat melekat pada untai DNA dengan kurang sempurna. Suhu Tinggi dapat
mengakibatkan salah sasaran, atau primer melekat pada urutan basa yang
salah. Suhu melting annealing
primer optimum dapat diukur dengan rumus Tm = 2 ( A+T ) + 4 ( G + C ). Setelah itu
dari masing masing dikurangi 5°C ( Suhu = Tm - 5°C ). Lalu hasil keduanya
dihitung rata – ratanya.
- Ekstention : Proses pemanjangan
untai DNA yang telah melekat pada primer. Suhu optimal yang dipakai 72°C,
bertujuan untuk mengaktifkan Enzim Taq Polimerase. Enzim Taq Polimerase
berasal dari bakteri Thermus
aquaticus. Penggandaanya n2.
- Post PCR : Tahap ini hanya
tahap optimalisasi proses running. Suhu 72°C, 1 Siklus, 7 Menit.
- Finalizing : Tahap
penyelesaian. Suhu 4°C.
- Fungsi Penambahan :
- ddH2O : Pelarut
dalam PCR mix.
- Buffer dream Taq : Penyangga
larutan.
- dNTP : Pembentuk Basa
Komplementer dan Penyusun DNA. Terkandung DNA template, Sepassang Primer,
dan campuran nukleotida. Berisi dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
- DNA template : cetakan DNA yang
akan diamplifikasi. Berisi sekuens target untuk penempelan primer.
- Taq Polimerase : Enzim
Polimerase.
- Faktor yang mempengaruhi :
- PCR mix (DNA template, Enzim
Polimerase, Buffer, dNTP, Primer)
- Temperature Annealing
- Panjang Siklus Tahap – tahap
PCR.
- Amplifikasi DNA : Metode untuk
melipatgandakan untai DNA target.
Sumber :
Laporan Praktikum Acara I ISOLASI DNA GENOM dari Escherichia coli
Laporan Praktikum Acara II ELEKTROFORESIS
Laporan Praktikum Acara III Polymerase Chain Reacion (PCR)
