Dasar Teori
Variasi teknik molekuler sangat beragam tergantung cara
pelaksanaan untuk mendapatkan data maupun tingkatan target data yang diinginkan
sesuai kemudahan pelaksanaan, kapabilitas sumber daya manusia, fasilitas dan peralatan,
serta kecukupan finansial (Karp et. al., 1997).
DNA berkualitas tinggi yang akan didapat dalam suatu
ekstraksi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi
molekuler, terutama dalam penandaan sidik jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium
Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA tanaman
yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol (Syafaruddin, 2011)
Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan
dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan
protein, serta pemurnian DNA (Surzycki, 2000).
Aplikasi seperti kloning, pelabelan dan sekuensing DNA sering
membutuhkan pemurnian fragmen DNA dari gel agarosa atau reaksi amplifikasi. Terdapat
dua sistem purifikasi fragmen DNA yang berbasis teknologi membran silika gel
(PCR System Clean-Up) dan berdasarkan MagneSil (Sequencing Reaction System
Clean-Up). Silika membran gel atau PCR System Clean Up menyediakan metode yang
dapat diandalkan untuk memurnikan DNA beruntai ganda, PCR-diperkuat DNA baik
secara langsung dari reaksi atau dari gel agarose. Metode cepat ini adalah
lebih sederhana untuk dilakukan, dan produk – produk PCR-nya dimurnikan dari
kontaminan (Dimer primer, aditif PCR dan primer amplifikasi) (Kheyrodin et.al.,
2012).
Untuk memurnikan produk PCR dari produk amplifikasi spesifik,
hasil reaksi dapat dipisahkan pada sebuah gel agarose sebelum purifikasi. Gel
agarose dilarutkan dengan penyangga chaotropic, membebaskan DNA untuk mengikat
membran silika. Selain itu PCR System Clean-Up juga dapat digunakan untuk memurnikan DNA dari reaksi
enzimatik seperti digesti dengan enzim restriksi dan perlakuan menggunakan
alkali fosfatase (Kheyrodin et. al., 2012).
Pembahasan
Molekul DNA yang sering digunakan dalam teknologi DNA
rekombinan adalah DNA plasmid dan DNA genom yang berasal dari sel bakteri. Pada
dasarnya isolasi DNA genom total dari sel bakteri terdiri dari beberapa tahap
yaitu:
- Kultivasi sel dalam media yang
sesuai
- Pemecahan dinding sel
- Ekstraksi DNA genom
- Purifikasi DNA
Pemecahan dinding sel bakteri dilakukan secara fisik misalnya
dengan cara sonikasi, maupun dengan cara kimia yaitu dengan menggunakan enzim
lisozim, etilen diamin tetra asetat (EDTA), atau kombinasi dari keduanya. Pada
kondisi tertentu pemecahan dinding sel cukup dilakukan dengan lisozim dan EDTA,
akan tetapi sering ditambahkan bahan lain yang dapat melisiskan dinding sel
antara lain deterjen triton X-100 atau sodium dedosil sulfat (SDS). Setelah sel
mengalami lisis, tahap selanjutnya adalah memisahkan debris sel dengan cara sentrifugasi.
Komponen sel yang tidak larut diendapkan dengan sentrifugasi sehingga
meninggalkan ekstrak sel dalam supernatan yang jernih (Radji, 2011).
Tahap akhir dari isolasi DNA adalah proses pemurnian DNA.
Disamping DNA, ekstrak sel mengandung protein dan RNA dalam jumlah yang cukup
besar. Umumnya cara pemurnian DNA dilakukan dengan penambahan larutan fenol
atau campuran fenol dan kloroform dengan perbandingan 1:1, untuk mengendapkan
protein dengan cara di sentrifugasikan dan dihancurkan secara enzimatis dengan
proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan RNA
sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA
yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara “presipitasi
etanol”. Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na+), pada suhu
-20°C etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah
dipisahkan dengan cara sentrifugasi (Radji, 2011).
Praktikum kali ini bertujuan agar mahasiswa mampu untuk
memahami dan mampu untuk melakukan metode purifikasi DNA Genom. Selain itu
diharapkan pula praktikan dapat memurnikan DNA Hasil PCR dan Isolat DNA Genom
Bakteri Gram negatif E. coli.
Pada dasarnya praktikum kali ini memiliki prinsip dasar pada
pemisahan DNA dari pengotornya sehingga didapatkan DNA murni atau genom yang
berkualitas tinggi melalui proses
pencucian, pengeringan, dan pelarutan.
Proses pertama dalam praktikum ini adalah memotong gel agarose
yang berisi fragmen DNA. Cara melihat pada bagian mana fragmen tersebut ada
dapat dengan menggunakan UV Transluminator. Setelah itu dilakukan penimbangan
potongan gel tersebut dalam ukuran miligram (mg). Setelah ditimbang potongan
gel tersebut segera dimasukkan ke dalam tube. Setelah berada dalam tube,
selanjutnya ditambahkan binding buffer dengan perbandingan banyaknya binding
buffer yang dimasukkan terhadap berat potongan agar sebesar 1:1. Digunakan
binding buffer karena bahan ini berguna dalam membantu pelisisan DNA.
Selanjutnya dilakukan inkubasi dalam inkubator shaker dengan kecepatan putaran
100 rpm dan dengan suhu antara 50° - 60 °C selama 10 menit. Inkubasi dengan
shaker ini bertujuan untuk mengoptimalkan pelisisan dan kerja enzim. Setelah
proses tersebut selesai, dilanjutkan dengan membolak balikkan tube selama satu
menit, hal ini bertujuan agar campuran yang ada dalam tube menjadi homogen.
Jika masih terdapat gel yang menjendal dapat segera dilakukan proses inkubasi
kembali. Setelah mendekati sempurna, proses dilanjutkan ke pemindahan larutan
ke Gen Jet Purification dan segera dilanjutkan ke proses sentrifugasi dengan
kecepatan 12000 rpm selama satu menit atau 60 detik, dan setelah selesai
supernatan yang dihasilkan segera dibuang. Kemudian dilanjutkan dengan
penambahan 700 µl wash buffer dan kemudian disentrifugasi kembali selama
semenit dan dengan kecepatan yang sama, yaitu 12000 rpm, serta kemudian
supernatan yang timbul dibuang kembali. Fungsi penambahan wash buffer tersebut
untuk mencuci DNA dari pengotor.
Setelah supernatan dibuang kembali dilakukan sentrifugasi dalam
keadaan coloumn kosong selama semenit dengan kecepatan 12000 rpm kembali, agar
fragmen DNA benar-benar bersih dari pengotor, setelah itu buang collection tube
yang berisi pengotor yang tersisa tersebut. Kemudian Gen Jet Coloumn
dipindahkan ke microsentrifuge 1,5ml. Setelah itu ditambahkan elution buffer
tepat di tengah coloumn. Hal ini bertujuan untuk presipitasi DNA atau
pengendapan DNA. Dilanjutkan kembali dengan sentrifuge 12000 rpm selama satu
menit. Setelah selesai Gen Jet Purification tersebut dibuang. Dan segera dapat
disimpan dalam microsentrifuge 1,5 ml pada suhu -20° C untuk dapat dipakai
kapan saja seperti proses elektroforesis.
Dari hasil yang didapati setelah proses elektroforesis dan
pendokumentasian dalam Gel Doc. Terlihat bahwa hanya marker saja yang mengalami
migrasi. Fragmen DNA yang sudah di-purifikasi tidak mengalami migrasi. Hal yang
semacam ini sangat dimungkinkan terjadi karena adanya faktor kontaminasi, masa
inkubasi, dan buffer yang digunakan.
Sumber :
Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W. G. Ayad, T. Hodgkin.
1997. Molecular tool in plant genetic
resources conservation: A guide to the technologies. IPGRI Technical
Bulletin. No. 2.
Kheyrodin, Hamid, Khosro Ghazvinian. 2012. DNA purification
and isolation of genomic DNA from bacterial species by plasmid purification
system. African Journal of Agricultural
Research Vol. 7(3), 19 January, 2012.
Kurnia, Ashfar. 2011. Dasar
Teknologi DNA Rekombinan. Universitas Indonesia Press : Jakarta.
Radji, M. (2011). Rekayasa
Genetika; Pengantar untuk Profesi Kesehatan. Sagung Seto: Jakarta.
Surzycki, S. 2000. Basic
Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New
York.
Syafaruddin, Tri Joko Santoso. 2011. OPTIMASI TEKNIK ISOLASI
DAN PURIFIKASI DNA YANG EFISIEN DAN EFEKTIF PADA KEMIRI SUNAN (Reutalis trisperma (Blanco) Airy Shaw). Jurnal Littri 17(1), Maret 2011.
