Biologi molekular atau
biologi molekul merupakan salah satu cabang biologi yang merujuk kepada
pengkajian mengenai kehidupan pada skala molekul. Ini termasuk penyelidikan
tentang interaksi molekul dalam benda hidup dan pengekspresiannya, terutama
tentang interaksi berbagai sistem dalam sel, termasuk interaksi DNA, RNA, dan
sintesis protein, dan bagaimana interaksi tersebut dapat diatur secara seimbang.
Bidang ini bertumpang tindih dengan bidang ilmu biologi (dan kimia) yang
lainnya, terutama genetika dan biokimia.
Hubungan
dengan Ilmu Biologi Lain
Para peneliti di
biologi molekuler masih menggunakan teknik khusus asli biologi molekular,
tetapi terus menggabungkan dengan teknik dan gagasan dari genetika dan
biokimia. Tidak ada garis definisi yang jelas antar disiplin ilmu. Hal tersebut
adalah skema yang menggambarkan satu pandangan kemungkinan hubungan antara
bidang:
- “Biokimia” adalah studi tentang zat kimia dan proses vital yang terjadi dalam organisme hidup. Ahli biokimia fokus dan menitikberatkan pada peran, fungsi, dan struktur biomolekul. Studi ini juga mempelajari tentang semua hal yang berhubungan dengan kimiawi yang ada di balik proses biologis dan sintesis molekul biologis aktif adalah contoh dari biokimia.
- “Genetika” adalah studi tentang pengaruh perbedaan genetik pada suatu organisme. Seringkali hal ini dapat disimpulkan dengan tidak adanya komponen yang normal (misalnya satu gen ). Studi tentang “mutan” atau organisme yang kekurangan satu atau lebih komponen fungsional yang berkaitan dengan “wild type” atau dapat disebut juga dengan fenotipe normal. Interaksi genetik (epistasis) seringkali dapat membingungkan suatu interpretasi sederhana seperti “knock-out” studi.
- “Biologi molekular” adalah studi tentang dasar-dasar molekul proses replikasi, transkripsi dan translasi bahan genetik. Dogma sentral biologi molekuler di mana bahan genetik ditranskripsikan menjadi RNA dan kemudian diterjemahkan menjadi protein, meskipun gambaran tersebut sudah disederhanakan oleh biologi molekuler, tetapi masih menyediakan titik awal yang baik untuk memahami seperti apa yang ada di lapangan.
Teknik
Biologi Molekuler
Sejak akhir 1950-an dan
awal 1960-an, ahli biologi molekuler telah belajar untuk mengkarakterisasi,
mengisolasi, dan memanipulasi komponen molekul sel dan organisme. Komponen-komponen
ini mencakup DNA, informasi-informasi genetik seperti; RNA, kerabat dekat DNA
yang berfungsi dalam sintesis protein, sementara DNA berfungsi dalam struktural
dan enzimatik aktual serta bagian fungsional dan pada struktural saat
translasi, juga protein, jenis struktural serta enzimatik utama dari molekul
dalam sel.
Ekspresi
kloning
Salah satu teknik yang
paling dasar biologi molekuler untuk mempelajari fungsi protein adalah kloning
ekspresi. Dalam teknik ini, DNA coding untuk suatu protein dari kloning
(menggunakan PCR dan / atau enzim restriksi) ke dalam sebuah plasmid (dikenal
sebagai vektor ekspresi). Plasmid ini mungkin memiliki elemen promotor khusus
untuk mendorong produksi protein yang menarik, dan mungkin juga memiliki penanda
resistensi antibiotik untuk membantu mengikuti plasmid.
Plasmid ini dapat
dimasukkan ke dalam sel-sel bakteri baik atau hewan. Memperkenalkan DNA ke
dalam sel bakteri yang dapat dilakukan dengan transformasi (melalui penyerapan
DNA telanjang), konjugasi (melalui kontak sel-sel) atau dengan transduksi
(melalui vektor virus). Memperkenalkan DNA ke dalam sel eukariotik, seperti sel
hewan, dengan cara fisik atau kimia yang disebut transfeksi. Beberapa teknik
transfeksi yang berbeda tersedia, seperti transfeksi kalsium fosfat,
elektroporasi, injeksi dan transfeksi liposom. DNA juga dapat diperkenalkan ke
dalam sel eukariotik menggunakan virus atau bakteri sebagai pembawa, yang
terakhir ini kadang-kadang disebut bactofection dan khususnya menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Plasmid dapat
diintegrasikan ke dalam genom, menghasilkan transfeksi stabil, atau mungkin
tetap independen dari genom, yang disebut transfeksi sementara.
Dalam kedua kasus, DNA
coding untuk suatu protein yang menarik sekarang di dalam sel, dan protein
sekarang dapat dinyatakan. Berbagai sistem, seperti promotor diinduksi dan
spesifik sel-sinyal faktor, yang tersedia untuk membantu mengekspresikan
protein kepentingan di tingkat tinggi. Jumlah besar protein kemudian dapat
diekstrak dari sel bakteri atau eukariotik. Protein dapat diuji untuk aktivitas
enzimatik bawah berbagai situasi, protein dapat mengkristal sehingga struktur
tersier yang dapat dipelajari, atau dalam industri farmasi, aktivitas obat baru
terhadap protein dapat dipelajari.
Polymerase
chain reaction (PCR)
Reaksi berantai
polimerase adalah teknik yang sangat serbaguna untuk menyalin DNA. Secara
singkat, PCR memungkinkan urutan DNA tunggal untuk disalin (jutaan kali), atau
diubah dengan cara-cara yang telah ditentukan. Sebagai contoh, PCR dapat
digunakan untuk memperkenalkan situs enzim restriksi, atau untuk bermutasi
(mengubah) basa tertentu DNA, yang terakhir adalah metode disebut sebagai “perubahan
cepat”. PCR juga dapat digunakan untuk menentukan apakah suatu fragmen DNA
tertentu ditemukan di perpustakaan cDNA. PCR memiliki banyak variasi, seperti
PCR transkripsi terbalik (RT-PCR) untuk amplifikasi RNA, dan, baru-baru ini,
real-time PCR (QPCR) yang memungkinkan untuk pengukuran kuantitatif molekul DNA
atau RNA.
Gel
elektroforesis
Elektroforesis gel
adalah salah satu alat utama biologi molekuler. Prinsip dasarnya adalah bahwa
DNA, RNA, dan protein semuanya dapat dipisahkan melalui medan listrik. Dalam
elektroforesis gel agarosa, DNA dan RNA dapat dipisahkan berdasarkan ukuran
dengan menjalankan DNA melalui gel agarosa. Protein dapat dipisahkan
berdasarkan ukuran dengan menggunakan gel SDS-PAGE, atau berdasarkan ukuran dan
muatan listrik mereka dengan menggunakan apa yang dikenal sebagai
elektroforesis gel 2D.
Makromolekul
blotting
Istilah “utara”, ”barat”
dan “timur” blotting berasal dari apa yang awalnya adalah lelucon biologi
molekuler yang dimainkan dijangka blotting selatan, setelah teknik yang
dijelaskan oleh Edwin Selatan untuk dengan hibridisasi DNA dari dihapuskan.
Patricia Thomas, pengembang dari noda RNA yang kemudian menjadi dikenal sebagai
“noda utara” sebenarnya tidak menggunakan istilah itu. Kombinasi lebih lanjut
dari teknik ini menghasilkan istilah-istilah seperti “southwesterns” (protein-DNA
hybridizations), “northwesterns” (untuk mendeteksi protein-RNA interaksi) dan “farwesterns”
(interaksi protein-protein), yang semuanya saat ini ditemukan dalam literatur.
Southern
blotting
Dinamai setelah
penemunya, biologi Edwin Selatan, Selatan Blot adalah metode untuk menyelidiki
keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel DNA. DNA sampel sebelum atau
setelah pencernaan enzim restriksi dipisahkan dengan elektroforesis gel dan
kemudian ditransfer ke membran dengan blotting melalui aksi kapiler. Membran
tersebut kemudian terkena probe DNA berlabel yang memiliki urutan basa
pelengkap untuk urutan DNA pada bunga. Kebanyakan protokol asli yang digunakan
label radioaktif, namun non-radioaktif alternatif yang sekarang tersedia.
Southern blotting kurang umum digunakan dalam ilmu laboratorium karena
kapasitas teknik lain, seperti PCR, untuk mendeteksi urutan DNA spesifik dari
sampel DNA. Bercak ini masih digunakan untuk beberapa aplikasi, bagaimanapun,
seperti mengukur jumlah salinan transgen pada tikus transgenik, atau rekayasa
gen sel induk garis KO embrio.
Northern
blotting
Blot utara digunakan
untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis tertentu molekul RNA sebagai
perbandingan relatif antara set sampel yang berbeda dari RNA. Ini pada dasarnya
adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel, dan sebuah noda. Dalam
proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran
yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya
dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan,
namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA
terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA
target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk
mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur
berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Ini adalah salah satu
alat yang paling dasar untuk menentukan pada waktu apa, dan dalam kondisi apa,
gen-gen tertentu yang dinyatakan dalam jaringan hidup.
Western
blotting
Antibodi terhadap
protein yang paling dapat dibuat dengan menyuntikkan sejumlah kecil protein
menjadi binatang seperti mouse, kelinci, domba, atau keledainya (antibodi poliklonal)
atau diproduksi dalam kultur sel (antibodi monoklonal). Antibodi ini dapat
digunakan untuk berbagai teknik analisis dan preparatif.
Di barat blotting,
protein yang pertama dipisahkan oleh ukuran, dalam gel tipis terjepit di antara
dua pelat kaca dalam teknik yang dikenal sebagai SDS-PAGE (natrium sulfat
dodesil poliakrilamida elektroforesis gel). Protein dalam gel kemudian
ditransfer ke PVDF, nitroselulosa, membran nilon atau dukungan lainnya. Membran
ini kemudian bisa dideteksi dengan solusi antibodi. Antibodi yang secara khusus
mengikat protein yang menarik kemudian dapat divisualisasikan oleh berbagai
teknik, termasuk produk berwarna, chemiluminescence, atau autoradiografi.
Seringkali, antibodi diberi label dengan enzim. Ketika substrat chemiluminescent
terkena enzim itu memungkinkan deteksi. Menggunakan teknik western blotting
memungkinkan deteksi tidak hanya tetapi juga analisis kuantitatif.
Metode analog dengan
Barat blotting dapat digunakan untuk langsung noda protein tertentu dalam sel
hidup atau bagian jaringan. Namun, metode “immunostaining”, seperti pada IKAN,
lebih sering digunakan dalam penelitian biologi sel.
Timur
blotting
Teknik blotting Timur
adalah untuk mendeteksi modifikasi pasca-translasi protein. Protein
mengeringkan ke nitroselulosa membran PVDF atau yang diperiksa untuk modifikasi
menggunakan substrat tertentu.
Array
Sebuah array DNA adalah
kumpulan bintik-bintik melekat pada dukungan solid seperti slide mikroskop
dimana spot masing-masing berisi satu atau lebih beruntai tunggal oligonukleotida
fragmen DNA. Array memungkinkan untuk meletakkan jumlah besar bintik-bintik
yang sangat kecil (100 diameter micrometre) pada slide tunggal. Setiap tempat
memiliki molekul DNA fragmen yang melengkapi urutan DNA tunggal (mirip dengan
blotting Selatan). Sebuah variasi dari teknik ini memungkinkan ekspresi gen
dari suatu organisme pada tahap tertentu dalam pembangunan yang berkualitas
(profiling ekspresi). Dalam teknik ini RNA dalam jaringan adalah terisolasi dan
diubah menjadi cDNA berlabel. Ini cDNA ini kemudian hibridisasi dengan fragmen
di array dan visualisasi hibridisasi dapat dilakukan. Sejak beberapa array
dapat dilakukan dengan posisi yang sama persis fragmen mereka sangat berguna
untuk membandingkan ekspresi gen dari dua jaringan yang berbeda, seperti
jaringan sehat dan kanker. Juga, kita dapat mengukur apa gen disajikan dan
bagaimana perubahan ekspresi yang dengan waktu atau dengan faktor lain. Sebagai
contoh, ragi roti yang umum itu, ”Saccharomyces cerevisiae”, mengandung
sekitar 7000 gen, dengan microarray, orang dapat mengukur secara kualitatif
bagaimana gen masing-masing dinyatakan, dan bagaimana bahwa perubahan ekspresi,
misalnya, dengan perubahan suhu.
Array juga dapat dibuat
dengan molekul lain dari DNA. Sebagai contoh, sebuah array antibodi dapat
digunakan untuk menentukan apa yang protein atau bakteri yang hadir dalam
sampel darah.
Oligonukleotida
spesifik alel
Oligonukleotida alel
spesifik (ASO) adalah teknik yang memungkinkan deteksi mutasi basa tunggal
tanpa memerlukan elektroforesis PCR atau gel. Pendek (20-25 nukleotida
panjang), probe berlabel terkena DNA target non-terfragmentasi. Hibridisasi
terjadi dengan kekhususan tinggi karena panjang pendek dari probe dan bahkan
perubahan basa tunggal akan menghambat hibridisasi. DNA target kemudian dicuci
dan probe label yang tidak berhibridisasi dihapus. DNA target kemudian
dianalisa untuk kehadiran probe melalui radioaktivitas atau fluoresensi. Dalam
percobaan ini, seperti dalam kebanyakan teknik biologi molekular, kontrol harus
digunakan untuk memastikan percobaan berhasil. Illumina Metilasi Assay adalah
contoh dari sebuah metode yang mengambil keuntungan dari teknik ASO untuk
mengukur satu perbedaan pasangan basa secara berurutan.
Teknologi
kuno
Dalam biologi
molekular, prosedur dan teknologi yang terus-menerus dikembangkan dan teknologi
yang lebih tua ditinggalkan. Misalnya, sebelum munculnya gel elektroforesis DNA
(agarosa atau Polyacrylamide), ukuran molekul DNA biasanya ditentukan oleh
tingkat sedimentasi di gradien sukrosa, teknik lambat dan padat karya yang
membutuhkan instrumentasi mahal; sebelum gradien sukrosa, viscometry digunakan
.
Selain dari kepentingan
sejarah mereka, sering perlu mengetahui tentang teknologi yang lebih tua,
karena kadang-kadang berguna untuk memecahkan masalah lain yang baru untuk
teknik yang lebih baru adalah tidak tepat.
Sumber :
